一、分光光度计测定微量铁原理
1、光度法测定的条件：分光光度法测定物质含量时应注意的条件主要是显色反应的条件和测定吸光度的条件。显色反应的条件有显色剂的用量，介质的酸度、显色时温度、显色时间及干扰物质的消除方法等；测量吸光度的条件包括入射光波长的选择、吸光度范围和参比溶液等。
2、二氮杂菲-亚铁络合物：邻二氮杂菲是测定微量铁的一种较好的试剂。在pH=2～9的条件下Fe2+离子与邻二氮杂菲生成稳定的橘红色络合物，此络合物的lgK稳=21.3,摩尔吸光系数ε510=1.1×104在显色前，首先用盐酸羟胺把Fe3＋离子还原为Fe2＋离子，其反应式如下：2Fe3＋+2NH2OH·HCl→2Fe2＋+N2+2H2O+4H++2Cl-测定时，控制溶液酸度在pH=5左右较为适宜。酸度过高，反应进行较慢；酸度太低，则Fe2+离子水解，影响显色。Bi3+，Cd2+，Hg2+，Ag+，Zn2+等离子与显色剂生成沉淀，Ca2+，Cu2+，Ni2+等离子与显色剂形成有色络合物。因此当这些离子共存时，应注意它们的干扰作用。
二、分光光度计测定微量铁试剂
10µg/mL的铁标准液；盐酸羟胺固体及10%溶液（因其不稳定，需临时用时配）；0.1%邻二氮杂菲（新配制）；1mol/LNaAc溶液。
三、标准铁的制备
称取0.7022g硫酸亚铁铵[Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O],溶于70ml硫酸溶液中,滴加0.02mol/L的高锰酸钾溶液至出现微红色不变,用纯水定容至1000ml。此贮备溶液1.00ml含0.100mg铁。
四、指示剂的选择
原则指示剂也有酸碱性，指示剂一般是有机物，酸碱浓度太大有可能破坏指示剂（少数），而且浓度太高你每一滴里的酸碱就多，不可能恰好滴合适的酸碱，总是要多半滴，浓度越高差的越多是根据所需要的PH值的确定的，其值在所选择的指示剂的突越范围内。这样溶液才能够有颜色的变化，才能够判断终点。
五、步骤
1、吸收曲线的绘制准确
移取10µg/mL铁标准溶液5mL于50mL容量瓶中，加入10%盐酸羟胺1mL，摇匀，稍冷，加入1mol/LNaAc溶液5mL和0.1%邻二氮杂菲3mL，以水稀释至刻度，在分光光度计上，用1cm比色皿，以水为参比溶液，用不同的波长从430nm开始到570nm为止，每隔10nm或20nm测定一次吸光度。然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘制吸收曲线，从吸收曲线上确定该测定的适宜波长。
2、铁含量的测定
（1）标准曲线的绘制：取50mL容量瓶（或比色管）6支，分别移取2mL、4mL、6mL、8mL，铁标准溶液于5支容量瓶中，另一容量瓶中不加铁标准溶液（配制空白溶液，作参比）。然后各加入1mL10%盐酸羟胺，摇匀，经2min后，再各加5ml1mol/LNaAc溶液及3ml0.1%邻二氮杂菲，以水吸稀释至刻度，摇匀。在分光光度计上，用1cm比色皿，在大吸收波长（510nm）处，测定各溶液的吸光度。以铁含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）未知液中铁含量的测定：分别二次吸取10mL未知液代替标准溶液，其它步骤均同上，测定吸光度。由未知液的吸光度在标准曲线上查出10mL未知液中的铁含量，然后以每毫升未知液中含铁多少微克表示结果。
3、绘制吸收曲线
六、未知铁量的测定
测的各标液的吸光度，画标准曲线；再根据未知铁液的吸光度，在标准曲线上找出对应的铁量，进而求未知溶液中铁的含量。
分光光度法测量的理论依据是朗伯-比耳定律：当一束单色光通过一定浓度的稀有色容液时，溶液对光的选择吸收程度A与溶液的浓L度或液层成正比即A=kcL=log(I0/I),式中：A为吸光度，表示光通过溶液时被吸收的强度；为有色溶液的浓度；I0为入射光强度；I为透射光强度；L为液层的厚度；为k吸光系数，它与入射光的波长及溶液的性质、温度等有关。当入射光强度I0、吸光系数k和溶液厚度L不变时，透射光强度I只随溶液中物质的量C而变化。因此，如果把通过溶液的光线通过测光机构中的光电转换接受器，并转换成电能，在微电计上就读出相应的透光率，从而推算出溶液浓度。
八、微量分光光度计使用注意事项
1、仪器预热后，开始测量前反复调透光率0%和透光率100%。
2、仪器连续使用不应超过2h，否则，好间歇0.5h后再使用。
3、比色皿洗涤必须干净，拿取比色皿时，只能用手捏住毛玻璃的两面，装待测液时，应用待测液润洗2-3次，保证待测液浓度不变，倒入的溶液应在2/3-3/4处而不要太满，放时应将透光面对着光路。
4、比色皿要根据溶液颜色的深浅选择厚度。
5、实验完后用的洗涤液以及蒸馏水洗净晾干后存放在比色皿盒内，不能用碱溶液和强氧化剂洗涤以免腐蚀玻璃或使比色皿粘接处脱胶。
6、测量时好从低浓度到高浓度进行，这样可减少误差。
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