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一、3D肿瘤球体的培养流程
1. 培养系统的选择
- 旋转式生物反应器（RWV）
- 通过持续旋转（速度通常为15-30 rpm）使细胞处于自由悬浮状态，减少剪切力损伤，促进细胞自聚集形成球体。
- 优势：适用于大规模培养，能生成均一性较好的球体。
- 案例：NASA的旋转壁容器常用于培养乳腺癌、胶质瘤等肿瘤球体。
- 悬滴法（Hanging Drop）
l 将细胞悬液滴加在培养板盖背面，利用重力作用使细胞在液滴底部聚集形成球体。
l 优势：操作简单，适合高通量药物筛选。
l 局限：球体尺寸较小（通常<500 μm），难以长期维持。
- 磁悬浮3D培养（如BioLevitator）
l 利用纳米磁性颗粒标记细胞，通过磁场抵消重力，形成无支架3D球体。
l 优势：快速成球（24-48小时），可精准控制球体大小。
- 基质胶（Matrigel）或水凝胶支持法
l 将肿瘤细胞嵌入富含ECM成分的基质胶中，模拟体内基质支撑。
l 优势：保留细胞-基质相互作用，适用于侵袭性研究。
2. 关键步骤与技术参数
1.细胞选择与预处理
l 使用患者来源的原代肿瘤细胞（PDCs）或肿瘤细胞系（如MCF-7、U87-MG）。
l 添加肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）、免疫细胞（如T细胞、巨噬细胞）共培养，模拟TME的异质性。
2. 培养条件优化
l 细胞密度：通常为5×10³~1×10⁴ cells/mL（过高易形成坏死核心）。
l 培养基：添加生长因子（如EGF、bFGF）、低血清（2-5% FBS）以抑制单层贴壁生长。
l 氧浓度：通过低氧培养箱（1-5% O₂）模拟肿瘤内部缺氧环境，激活HIF-1α通路。
3. 动态监测与质量控制
l 球体尺寸：通过显微镜或自动成像系统监测（目标直径：200-1000 μm）。
l 活性检测：Calcein-AM（活细胞绿色荧光）/碘化丙啶（PI，死细胞红色荧光）双染色。
l 代谢分析：检测乳酸分泌、葡萄糖消耗评估代谢重编程（Warburg效应）。
二、模拟肿瘤微环境的关键策略
1. 细胞异质性共培养
l 肿瘤细胞 + 基质细胞：共培养CAFs、内皮细胞（模拟血管生成）或间充质干细胞（MSCs）。
l 免疫细胞浸润模型：加入T细胞、巨噬细胞（如THP-1来源的M2型），研究免疫逃逸机制。
2. 细胞外基质（ECM）的调控**
l 基质成分：添加胶原蛋白（Ⅰ/Ⅳ型）、纤连蛋白、透明质酸，模拟肿瘤ECM的刚性（5-20 kPa）。
l 动态ECM重塑：利用酶（如MMP-2/9）或机械刺激模拟肿瘤侵袭过程中的基质降解。
3. 梯度氧与营养供应
l -氧梯度：通过微流控芯片（Organ-on-a-chip）在球体中建立氧浓度梯度，模拟核心缺氧与边缘富氧区域。
l -药物渗透测试：将阿霉素等化疗药加入系统，观察球体内部药物分布差异（与外层相比，核心药物浓度可能降低10倍以上）。
三、3D肿瘤球体的应用场景
1. 肿瘤生物学研究
l 侵袭与转移：通过Transwell实验或活细胞成像，观察球体细胞向周围基质的迁移能力。
l 耐药性机制：比较2D与3D培养中肿瘤细胞对顺铂、紫杉醇的IC50差异（3D模型通常耐药性高10-100倍）。
2. 个性化药物筛选
l 患者来源肿瘤球体（PDOs）：将手术样本直接培养为球体，测试个体化化疗方案（敏感性预测准确率>80%）。
l 免疫治疗评估：将PD-1/PD-L1抑制剂与肿瘤球体+免疫细胞共培养，检测T细胞杀伤效率。
3. 肿瘤-微环境互作研究
l 血管生成实验：在球体中嵌入内皮细胞，观察微血管网络的形成（VEGF抑制剂可显著抑制此过程）。
l 代谢交互作用：通过代谢组学分析肿瘤细胞与CAFs之间的乳酸-谷氨酰胺交换。
四、技术挑战与优化方向
1. 标准化问题
l 不同实验室的球体尺寸、细胞比例差异较大，需建立统一评价标准（如MINAST准则）。
2. 血管化与长期培养
l 现有球体内部易坏死（>500 μm时），需结合生物打印技术构建血管化通道。
3. 高内涵分析技术
l 开发AI驱动的图像分析算法，自动量化球体形态、细胞分布及药物响应。
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