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荧光定量PCR仪的部分技术问题解析

更新时间:2017-07-07浏览:1825次
  1.荧光定量PCR仪扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
  ·常见的原因在于反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系;
  ·与反应起始时RNA的总量及纯度有关;
  ·建议在试验中加入对照RNA;
  ·*链的反应产物在进行PCR扩增时,在总的反应体系中的含量不要超过1/10;
  ·目的mRNA中含有强的转录中止位点,可以试用以下方法解决:
  ①将*链的反应温度提高至50℃。
  ②使用随机六聚体代替dT进行*链反应。
  2.产生非特异性条带
  ·用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的荧光定量PCR仪测试结果也显示同样条带,则需要用DNase I重新处理样品;
  ·在PCR反应中,非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火,降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生;
  ·由于mRNA剪切方式的不同,根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。
  3.产生弥散条带
  ·在PCR反应体系中*链产物的含量过高;
  ·减少引物的用量;
  ·优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数;
  ·在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时,其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增,一般会显示为弥散背景。
  4.产生大分子量的弥散条带
  ·大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的;
  ·对于长片段的PCR,建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10。
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