虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的
定量PCR仪技术，探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的，这主要是因为相对于荧光染料，探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR仪要求。当然定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般定量PCR仪实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
总体原则：
先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
所选序列应该高度特异，尽量选择具有小二级结构的扩增片段—这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）。
将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
探针位置尽可能地靠近上游引物。
定量PCR仪检测探针的DNA折叠和二级结构。
整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量—G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
为确保引物探针的特异性，好将设计好的序列再核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
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