荧光定量PCR仪引物设计的相关知识

　　荧光定量PCR仪引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
　　要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
　　现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
　　让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。
　　同时荧光定量PCR仪引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
　　引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
　　综上所述可归纳十条荧光定量PCR仪引物的设计原则：
　　1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
　　2.产物不能形成二级结构。
　　3.引物长度一般在15~30碱基之间。
　　4.G+C含量在40%~60%之间。
　　5.碱基要随机分布。
　　6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
　　7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
　　8.引物5′端可以修饰。
　　9.引物3′端不可修饰。
　　10.引物3′端要避开密码子的第3位。