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荧光定量PCR仪引物设计的相关知识

更新时间:2017-07-17浏览:1758次
  荧光定量PCR仪引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
  要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。
  现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对。
  让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。
  同时荧光定量PCR仪引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
  引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列;标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增的特异性影响不大。但3′端不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。
  综上所述可归纳十条荧光定量PCR仪引物的设计原则:
  1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
  2.产物不能形成二级结构。
  3.引物长度一般在15~30碱基之间。
  4.G+C含量在40%~60%之间。
  5.碱基要随机分布。
  6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
  7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
  8.引物5′端可以修饰。
  9.引物3′端不可修饰。
  10.引物3′端要避开密码子的第3位。
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