荧光定量PCR仪PCR扩增后的问题分析

　　荧光定量PCR仪厂家分析PCR扩增各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
　　PCR扩增出现非特异性扩增带：
　　荧光定量PCR仪的PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：
　　引物与靶序列不*互补、或引物聚合形成二聚体；
　　Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关；
　　酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
　　对策：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；适当提高退火温度或采用二温度点法。
　　PCR扩增出现片状拖带或涂抹带：
　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶；减少dNTP的浓度；适当降低Mg2+浓度；增加模板量，减少循环次数。