荧光定量PCR仪相关对照问题的处理

　　1.阴性对照和阳性对照都出现阳性扩增带

　　原因：

　　①阴性样品和PCR反应试验污染。

　　②电泳上样时避免PCR产物漂移到其他孔而影响结果判定。

　　解决方法：

　　①更换全部试剂，必要时更换所有移液器。

　　②应小心操作，或琼脂糖凝胶加厚，增加每孔的容量，可避免加样液的溢出。

　　2.阳性对照呈阴性

　　原因：

　　①阳性样品或加入阳性模板失效。无论是组织还是血清，冻融1次后病原数量明显减少。

　　②加入试剂量不准确或遗忘了某一成分。

　　解决方法：

　　①将阳性对照样品分成小包装。每个包装够用1次好。

　　②仔细核对试验记录，校对移液器。

　　3.出现非特异扩增带

　　原因：

　　①样品模板量过多。

　　②引物或TaqDNA聚合酶多。

　　③镁离子浓度过高或退火温度过低。

　　解决方法：

　　依据荧光定量PCR仪具体实验的情况，分析上述可能出现的原因，采取相应的措施。

　　4.阳性对照扩增带弱

　　原因：

　　①电泳时琼脂糖中EB含量少或长时间后再用已失效。

　　②扩增效率不高。

　　解决方法：

　　①是将琼脂糖凝胶放入含有EB电泳液中再染30 min后再观察。

　　②检测仪器是否正常工作。

　　③增加纯化DNA或cDNA样品的稀释倍数。