BD流式细胞仪细胞周期/DNA分析方法

 

0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。

 

二、制备一个阴性对照来

 

    设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下1-6）

 

三、若做DNA倍体分析，需另设附加对照

 

    管肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管，比例至少为2：1

 

四、BD流式细胞仪细胞周期/DNA分析实验步骤

 

1、将细胞消化后，用冷PBS洗细胞两次，300g×5min（若细胞数过少可提高转速到500g），为减少细胞损失可用1.5ml离心管离心；

2、弃上清留大约50ul下面的液体防止碰到细胞团，加入1mlBufferSolution并低速混匀细胞。

3、室温离心，300g×5min；

4、重复2、3一次；

5、弃上清留大约50ul下面的液体，加入1mlBufferSolution重悬细胞；

6、计数细胞，用BufferSolution将细胞密度调为1×106个/ml；

7、染色：

A．取0.5ml含细胞5×105个；

B．每管加入250ulSolutionA，用手轻拍混匀（勿用漩涡混匀）；

C．室温反应10min，保留SolutionA；

D．加入200ulSolutionB，轻轻混匀；

E．室温反应10min，保留SolutionA+B；

F．加入200ul冷SolutionC，轻轻混匀，黑暗处2-8℃孵育10min；

用50um尼龙网过滤细胞，加入上样管上流式分析（3h内分析完）。